服务 | ELISpot——小点大用

   酶联免疫斑点技术(Enzyme Linked Immunospot Assay，ELISpot) 是一种可以检测单细胞水平对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测的高灵敏度检测方法，具有高特异性、生理相关性高、易操作等特点，已被广泛用于疫苗领域药效学评估，是 mRNA 感染性疫苗和 mRNA/DC 肿瘤疫苗药效学评估中关键的技术方法，也是AAV based药物细胞免疫原性评估重要的技术手段，在国内外免疫学研究深受认可，已被纳入多项国内外指导指南中。

实验原理 & 步骤

   ELISpot 板底上事先预包被被生物素标记的特异性单抗，这些单抗会捕获淋巴细胞受到抗原刺激后会局部产生细胞因子，其后再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的亲和素结合。加底物显色后，底板的 PVDF 膜上出现紫色或红褐色的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过对斑点进行计数和分析，结合免疫细胞的来源选择，刺激物的类型，刺激方式的不同等，衍生出多种多样的应用方向。

ELISpot检测原理示意图。PMID: 25149304

   目前 ELISpot 技术最为广泛应用的领域是用于感染性疫苗的临床阶段的药效学评估。通常采用跟宿主受体结合的病毒蛋白多脑库作为刺激物，并取临床受试者的免疫细胞进行共孵育培养。一般使用T细胞，有时会将T细胞进行细分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，搭配ELISpot 技术来进行疫苗的细胞免疫药效学评估。

   ELISpot 技术也是肿瘤疫苗进行临床阶段药效学评估的重要检测和筛选技术。相对于感染性疫苗，肿瘤疫苗引起人体的免疫反应较弱，同时由于肿瘤的异质性，肿瘤疫苗需要表达多样化的肿瘤相关抗原或者新生抗原来使患者获得对于肿瘤的免疫能力。基子ELISpot 技术的高灵敏性在肿瘤疫苗进行早期药效学评估、判断疫苗中各个相关抗原或新生抗原是否对人体有效，以及支持后续的临床决策中，是非常关键的检测技术。

   在 CDE 发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究》指导原则中也强调了 mRNA 疫苗的质量研究需要进行体外效力试验，推荐使用 ELISpot 技术检测评价 mRNA 疫苗的细胞免疫反应。

优势

• 高灵敏度
• 高特异性
• 高通量
• 准确易呈现

ELISpot 影响因素

   ELISpot 作为最为灵敏的检测技术之一，有很多的因素会对结果造成影响，尤其受到样品PBMC本身的质量影响。如果PBMC 分离或保存不当，很可能会失去功能学活性，导致假阴性。

   澳能生物作为国内一流的原代免疫细胞供应商，有丰富的 PBMC 优选和免疫细胞培养经验，可进行有多肽复合物的抗原递呈细胞的培养和制备，设计更加复杂也更加灵敏的 ELISpot 检测方法。

数据展示

ELISpot 检测不同 Donor 的 PBMC 经 T 细胞抗原刺激后的 IFN-γ 分泌情况：原始图像（左），计数图像（右）

抗原：A1-A8 & G1-G2：CEFTA；B1-B8 & H1-H2：CEF；C1-C8 & G3-G4：EBV；D1-D8 & H3-H4：CMV；E1-E8 & G5-G6：α-CD3（阳性对照）；F1-F8 & H5-H6：Medium（阴性对照）；G7-G8 & H7-H8：空白孔。

ELISpot 检测不同 Donor 的 PBMC 经 T 细胞抗原刺激后的 IFN-γ 分泌情况统计图。（SFU：Spot Forming Units，斑点形成单位）

ELISpot应用方向

免疫学基础研究

   T 细胞和 B 细胞，Th0 / Th1 / Th2 细胞转换分析。通过 ELISpot 检测临床试验和候选疫苗试验中的抗原特异性 T 细胞免疫的金标准。

   Elispot 也可用于通过使用其他细胞因子来区分活化 T 细胞的不同亚群，例如 Th1 型细胞（产生 IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-12、IL-21 和 TNF-α），Th2 型细胞（产生 IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13）和 Th17 型细胞（产生 IL-17）。

感染性疾病诊断与研究

   如结核病的临床诊断，莱姆病、艾滋病等传染病的研究。对于结核分枝杆菌（MTB），使用 ELISpot 检测 IFN-γ 的低成本，高灵敏度和易用性，让它成为了区别感染个体的潜在方法。

自身免疫病研究

   调整机体免疫调节功能，对自身免疫病的治疗提供更有效的措施。

过敏研究

   参与过敏机制的细胞因子研究。