服务 | mRNA 疫苗细胞免疫反应评估

新冠疫情的爆发，加速了 mRNA 的临床商业化和蓬勃发展，今年的诺贝尔生理学或医学奖更是授予美国科学家卡塔琳·考里科（Katalin Karikó）和德鲁·韦斯曼（Drew Weissman），以表彰他们在信使核糖核酸（mRNA）研究上的突破性发现，使针对新冠感染的有效 mRNA 疫苗的开发成为可能。

mRNA 疫苗知多少

mRNA 表达的抗原蛋白能否有效地激活免疫系统？能否产生持久的抗体和细胞免疫？是否存在不良反应？哪些因素会影响疫苗效力？要解答这些问题，都可以通过进行 mRNA 疫苗的免疫原性分析。mRNA 疫苗的免疫原性主要来自三个方面，分别是序列本身、mRNA 的翻译产物以及递送载体，如 LNP。在 CDE 发布的《肿瘤主动免疫治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》，《新型冠状病毒预防用疫苗非临床有效性研究与评价技术要点（试行）》，《药物免疫原性研究技术指导原则》和FDA发布的多个文件中，如：《Guidance for Industry - Clinical Considerations for Therapeutic Cancer Vaccines》，《Guidance for Industry - Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID - 19》中都就 mRNA 疫苗免疫原性分析予以了指导规范。

图一  新型冠状病毒预防用 mRNA 疫苗药学研究技术指导原则（试行）

酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay，ELISpot）在多个指导原则中被推荐用于评价 mRNA 疫苗的细胞免疫反应。是一种可以检测单细胞水平对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测的高灵敏度检测方法，具有高特异性、生理相关性高、易操作等特点。ELISpot 的原理是利用预先包被在微孔板上的特异性抗体来捕获细胞分泌的蛋白，并通过酶联反应和显色或荧光反应来形成可见的斑点。每个斑点代表一个分泌蛋白的细胞，通过计数斑点的数量和大小，可以反映出细胞分泌蛋白的频率和水平。ELISpot 可以检测多种类型的蛋白，如抗体、细胞因子、趋化因子、杀伤素等。

图二  研究者基于 IFN-γ ELISpot 试验采用 SARS-CoV-2 刺突蛋白肽库检测了 mRNA-1273 、 BNT162b 以及 Ad26.COV2.S 三种疫苗免疫机体后的 T 细胞免疫应答

ELISpot 试验过程中，PBMC 的生物学功能对试验结果的准确性至关重要。临床中心提取全血后到分离 PBMC 的时长、提取方式、冻存方式、运输条件、解冻 & 复苏步骤等环节均可能会影响到 PBMC 的活性，并进一步影响后续试验结果的评估。因此，ELISpot 试验前需要规范化PBMC的处理方式，在保留较大提取收率的同时，维持其生物学活性。澳能生物作为国内领先的 PBMC 供应平台，拥有超过千人的志愿者库与近百种原代免疫细胞现货，提供健康人外周原代细胞、动员外周原代细胞、脐血原代细胞的分离及分选服务。公司具备丰富对 ADCC、ADCP、MLR、T 细胞增殖、TDCC 等功能实验及人源化小鼠模型重建进行了大批量的筛选的经验，研究者可根据研究需求，选用相应的批次，以减少个体差异带来的影响，降低研发成本，加快研发进程。

澳能数据展示

图三  ELISpot 检测不同 Donor 的 PBMC 经 T 细胞抗原刺激后的 IFN-γ 分泌情况：原始图像（左），计数图像（右）抗原：A1-A8 & G1-G2：CEFTA；B1-B8 & H1-H2：CEF；C1-C8 & G3-G4：EBV；D1-D8 & H3-H4：CMV；E1-E8 & G5-G6：α-CD3（阳性对照）；F1-F8 & H5-H6：Medium（阴性对照）；G7-G8 & H7-H8：空白孔。

图四  ELISpot 检测不同 Donor 的 PBMC 经 T 细胞抗原刺激后的 IFN-γ 分泌情况统计图（SFU：spot forming units，斑点形成单位）