技术小站 | 如何制备ELISpot所需的PBMC

Enzyme Linked Immunospot Assay

血液是我们身体中流动的信息之源，其中蕴含着丰富的免疫系统信息。Elispot技术作为一种有效评估T细胞和B细胞反应的方法，在研究免疫反应中发挥着关键作用。然而，在进行Elispot实验之前，必须先分离出外周血单个核细胞（PBMC）。

PBMC的分离

PBMC主要由淋巴细胞（T、B和NK细胞）和单核细胞组成，在免疫反应研究中具有重要意义。常见的PBMC分离方法——Ficoll密度梯度离心法，可以将PBMC从全血/单采血中分离出来。该方法利用了不同细胞类型的密度差异，使得红细胞和粒细胞沉淀到底部，而PBMC则形成一个清晰的环状带，俗称“白膜层”。

图一  血液在通过Ficoll梯度密度离心分离后，会在Ficoll层的上方出现PBMC环状带（白膜层）。doi: 10.1007/978-3-319-45295-1

分离要点

若想获得高质量的PBMC，可以通过控制制备时几个要点，来获得不错的结果：

分层清晰

Ficoll和血液必须在管子中加入而不混合在一起。可以通过在血液下方加入Ficoll，或非常缓慢和小心地将采集的血液加入Ficoll之上。[1]

温度控制

Ficoll的温度必须控制在室温范围（18-20°C）内，以确保分离效果。较低的温度会妨碍红细胞和粒细胞渗透到较高密度的Ficoll中，因此会导致PBMC回收纯度不高；较高温度下，Ficoll的密度较低，使得单个核细胞进入Ficoll层，导致PBMC的回收率降低。

降低浓度

离心前将血液加入PBS进行稀释，可以减少红细胞聚集物对PBMC分离的干扰。

时间间隔

血液采集和PBMC分离之间的时间间隔，对Elispot实验的结果至关重要。研究表明，PBMC的分离应在血液抽取后的8小时内完成，以避免粒细胞激活对分离结果产生负面影响。[2-3]

粒细胞对ELISpot的影响

稀释PBMC

粒细胞激活后改变了其浮力曲线，导致在Ficoll梯度离心过程中无法有效分离出符合ELISpot实验要求的PBMC，导致PBMC被稀释，进一步使得斑点数减少。[4-5]

破坏斑点

激活的粒细胞可能通过其Fc受体与Elispot板中的捕获抗体结合，导致斑点图像边缘出现白色点状。[6]

图二  ELISpot实验中的斑点周围，因粒细胞污染，出现白色破坏斑点。doi: 10.1007/978-3-319-45295-1

抑制T细胞

粒细胞激活释放过氧化氢，激活精氨酸酶，导致CD3ζ链表达的下调，从而干扰T细胞受体（TCR）信号传导，进而干扰T细胞受体信号传导，导致T细胞功能抑制。[4-5, 7-8]

PBMC for ELISpot

ELISpot 作为最为灵敏的检测技术之一，有很多的因素会对结果造成影响，尤其受到样品 PBMC 本身的质量影响，和Donor本身免疫状态影响。澳能生物作为国内一流的原代免疫细胞供应商，通过规范的招募、采集、冻存流程，保证低粒细胞的PBMC分离，并且通过ELISpot检测IFN-γ的分泌量，预先筛选对多种CD4+ 或CD8+ T细胞抗原更敏感的批次，在保证低粒细胞的同时，找出更适合进行ELISpot的PBMC。

图三  ELISpot 检测不同 Donor 的 PBMC 经 T 细胞抗原刺激后的 IFN-γ 分泌情况：原始图像（左），计数图像（右）抗原：A1-A8 & G1-G2：CEFTA；B1-B8 & H1-H2：CEF；C1-C8 & G3-G4：EBV；D1-D8 & H3-H4：CMV；E1-E8 & G5-G6：α-CD3（阳性对照）；F1-F8 & H5-H6：Medium（阴性对照）；G7-G8 & H7-H8：空白孔。

图四  ELISpot 检测不同 Donor 的 PBMC 经 T 细胞抗原刺激后的 IFN-γ 分泌情况统计图。（SFU：Spot Forming Units，斑点形成单位）

我们拥有丰富的 PBMC 优选和免疫细胞培养经验，可进行有多肽复合物的抗原递呈细胞的培养和制备，设计更加复杂也更加灵敏的 ELISpot 检测方法。

refs.
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